Пцр у кошек анализ что это такое

Коронавирусная инфекция кошек вызывает два вида заболеваний:

1. Кишечный коронавирус кошек (ККВК, или FCoV) — у котят приводит к лёгкой или средней по степени тяжести диарее в течение нескольких дней, а взрослые животные как правило являются бессимптомными вирусоносителями. Данный вирус является контагиозным и передаётся главным образом через фекалии.

2. Инфекционный перитонит кошек (ИПК или FIP) — вызывается высоко патогенными штаммами коронавирусов и приводит к развитию различных по тяжести клинических симптомов. Разделяется на два типа: сухой и выпотной перитонит.

FIP и FCoV относятся к РНК-содержащим вирусам из семейства Сoronaviridae. Они относительно устойчивы в окружающей среде (в каловых массах сохраняются до 48 часов при соответствующей температуре), устойчивы в кислой среде; 70%-й раствор спирта инактивирует их в течение 10 минут, эффективны гипохлоридные и другие антивирусные дезинфицирующие средства.

FIP является мутацией FCoV, которая может иногда происходить спонтанно во время инфекции. После мутации FIP проникает в клетки крови моноциты, где реплицируется и разносится с ними по всему организму.

Основным путём внедрения вируса является ороназальный: вирус размножается в носоглотке, миндалинах и клетках кишечника (энтероцитах). Если у кошки есть напряженный иммунный ответ при низкой патогенности вируса, может быть только лёгкий понос или вообще отсутствие клинических признаков. Если же клеточный иммунитет средней степени, то нарушения развиваются медленно, давая начало хроническому сухому перитониту. Если у кошки слабый клеточный иммунный ответ, то острый выпотной перитонит развивается очень быстро. В зависимости от степени поражения сосудов возможно развитие «влажного» (экссудативного, образуется выпот) или «сухого» перитонита (образуются пиогранулёмы в органах брюшной полости).

Еще до появления клинических симптомов и элиминации вируса некоторые кошки становятся устойчивыми вирусоносителями и играют важную роль в эпизоотологии коронавирусной инфекции кошек.

Инкубационный период длится от нескольких недель до нескольких месяцев. Инфекционный перитонит наиболее опасен при групповом содержании кошек, в кошачьих питомниках. Владельцы, решившие взять кошку с улицы или из питомника, при наличии других кошек в доме, должны поместить ее на 2-х недельный карантин в отдельное помещение и обследовать на FIP.

Предварительный диагноз ставится на основании клинических признаков. Часто требуются дополнительные исследования: общеклинический и биохимический анализы крови, анализ выпота брюшной или грудной полости, исследование сыворотки крови животного для обнаружения антител к коронавирусу, метод ПЦР для определения РНК вируса. Также возможна серологическая диагностика этих заболеваний.

Материал для исследования методом ПЦР выбирается в зависимости от клинических симптомов и типа короновирусной инфекции:

• плазма крови в объеме не менее 300 — 500 мкл — при сухом и выпотном FIP;
• асцитная жидкость в объеме не менее 300 — 500 мкл — при выпотном FIP;
• фекалии 5-10 г отбирают в стерильные контейнеры — при FCoV.

Материал доставляют в лабораторию в день взятия или на следующий день, сохраняя при температуре от 2 до 8°С. Допускается хранение вышеперечисленного материала при температуре не выше минус 16 °С в течение 1 нед, при температуре не выше минус 68°С длительно.

Если необходимо длительное хранение фекалий, из них готовят 10-20% суспензию на стерильном физиологическом растворе, центрифугируют при 10-12 тыс об/мин в течение 2 мин., надосадочную жидкость в объёме 400-800 мкл переносят в новую пробирку и добавляют глицерин до концентрации 20% (или другой криопротектор). Допускается хранение надосадосной жидкости при температуре не выше минус 16 °С. Допускается только однократное размораживание образца.

Следует помнить, что при диагностике методом ПЦР возможно появление ложноположительных результатов, связанных с тем, что метод, обладая высокой чувствительностью, может реагировать на вакцинный штамм, поэтому необходимо, чтобы после вакцинации прошло не менее 3-х недель.

Метод ПЦР позволяет идентифицировать небольшое количество короновирусов в асцитной жидкости, плазме или фекалиях. Однако реакция не способна дифференцировать FIP от FCoV. ПЦР эффективна для выявления вирусоносителей, но однократный положительный или отрицательный результат не имеет значения, так как кошки выделяют вирус периодически или они могут быть инфицированы недавно. Чтобы идентифицировать хронических носителей, необходимо получить несколько положительных анализов из фекалий за 8 — месячный период.

Коронавирус кошек обнаружен

• при наличии явных клинических признаков означает, что кошка больна FIP;
• при отсутствии клинических признаков, означает, что кошка инфицирована авирулентным FCoV;
• кошка была инфицирована коронавирусом, элиминировала его, но осталась вирусоносителем;
• животное было недавно привито против коронавирусов.

Коронавирус кошек не обнаружен

• кошка здорова;
• кошка является вирусоносителем и нерегулярно выделяет вирус.

Коронавирусные инфекции кошек и собак вызываются представителями рода Coronavirus (семейство Coronaviridae). Основным проявлением коронавирусной инфекции у собак является диарея. V кошек коронавирусы вызывают энтериты и инфекционный перитонит, широко распространенные среди диких и домашних кошек.

Возбудителем коронавирусной инфекции у собак является Canine coronavirus, вызывающий острый коронавирусный энтерит. Заболевание передается при непосредственном контакте с носителем вируса (через слюну и фекалии). Данной инфекции подвержены собаки любого возраста, однако чаще всего поражаются щенки и ослабленные животные, которые уже перенесли другую болезнь, например парвовирусную инфекцию.

Основные симптомы заболевания — рвота и диарея, иногда с примесью крови, обезвоживание организма, потеря в весе, апатия. Через 3-4 недели после выздоровления может развиться повторное заболевание. При проведении диагностики коронавирусный энтерит собак необходимо дифференцировать от парвовирусного энтерита, аденовирусной инфекции кишечного типа и чумы плотоядных.

Коронавирусы, поражающие кошек, представлены двумя биотипами: FECV, или коронавирус энтерита кошек, и FIPV — вирус инфекционного перитонита кошек (2, 3). Носителями FECV является 16-50% домашних кошек, у которых вирус локализуется в тонком кишечнике, не вызывая заболевания или становясь причиной легкой диареи. В то же время у 5-12% носителей может наблюдаться мутация условно-патогенной кишечной формы FECV в патогенную (FIPV), что приводит к развитию болезни (2).

Инфекционный перитонит (ИП, FIP) кошек, заканчивающийся, как правило, летально, протекает в двух формах — влажной и сухой. Влажная (экссудативная) форма ИП характеризуется поражением кровеносных сосудов брюшной или грудной полостей, сопровождающимся выпотеванием плазмы в указанные полости (рис. 1). У больных животных, развивается асцит (рис. 2), а в случае скопления жидкости — нарушение функции дыхания. На серозных покровах органов брюшной полости формируются фибринозные наложения (рис. 3), в дальнейшем могут образовываться спайки. Вследствие нарушения функции печени наблюдается эктеричность склер и кожных покровов.

Сухая (неэкссудативная) форма ИП протекает без скопления жидкости в брюшной и грудной полостях. В этом случае страдают внутренние органы — головной мозг (рис. 4), печень, почки, поджелудочная железа, в 25% случаев наблюдаются поражения глаз (рис. 5) (5).

Поскольку эффективная схема лечения ИП пока не разработана, первостепенное значение имеют профилактические меры, направленные на раннее выявление вирусоносительства (1, 3).

Материалы и методы В исследовании был использован штамм коронавируса «Багира» (5 1оg ТЦД50/мл) в разведениях, 8 изолятов коронавирусов кошек (FCoV), 2 изолята коронавируса собак (CCV) и суспензии вируса панлейкопении кошек и калицивируса кошек. При испытании ПЦР-тест-системы использовался биологический материал здоровых кошек, животных с клиническими признаками ИП и кошек с неспецифическими симптомами. Среди исследованных животных были как содержащиеся в питомниках, так и находящиеся на индивидуальном содержании. Биологический материал параллельно исследовался методами ПЦР и РИГА. С помощью ПЦР-системы исследовались фекалии, плазма крови, транссудат при специфическом асците, а методом РИГА — сыворотка крови и транссудат.

Серологические тесты проводились с использованием набора для выявления антител к коронавирусам плотоядных в РИГА (ТУ 9388-025-00494189-01). Биологический материал собак исследовался методом ПЦР.

Однако данное исследование требует значительных затрат времени и средств. В связи с этим эффективным методом диагностики ИП может служить полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая позволяет не только выявлять коронавирусы кошек, но и проводить дифференциацию условно-патогенных и патогенных штаммов исходя из различной локализации их в организме. При этом обнаружение вируса в фекалиях кошек свидетельствует о носительстве условно-патогенных штаммов (FECV), а в плазме крови или асцитной жидкости — о циркуляции в организме животного патогенных штаммов (FIPV) и, следовательно, о заболевании.

Цель настоящего исследования — испытание тест-системы для диагностики коронавирусной инфекции у кошек и собак на основе ПЦР.

Выделение РНК проводилось с использованием набора «РНК-сорб» (ЦНИИЭ), в основе которого лежит метод ее сорбции на силикагеле. ПЦР проводилась на амплификаторе ТЕРЦИК («ДНК-технология») по стандартной методике. Полученные ПЦР-продукты визуализировались методом электрофореза в 1,5% агарозном геле, содержащем бромистый этидий.

Результаты и обсуждение В процессе исследования проведен анализ сведений о нуклеотидных последовательностях представителей семейства Coronaviridae, в частности различных изолятов коронавирусов кошек и собак, опубликованных в базах данных Entrez, GeneBank, EMBL и DDBJ. Кроме того, изучена литература, характеризующая структуру геномов FCoV, CCV и их генетическое родство с другими представителями семейства.

В качестве мишеней для специфических праймеров были выбраны две консервативные последовательности в гене нуклеокапсидного протеина. Специфичность предложенных праймеров изучалась с помощью компьютерных программ FASTA и BLASTA. В результате проведенной работы была выявлена гомология выбранных олигонуклеотидов только с генами нуклеокапсидного протеина FCoV и CCV и не обнаружено их значимой гомологии с нуклеотидными последовательностями иных видов семейства Coronaviridae, а также каких-либо других вирусов, бактерий или эукариот. Таким образом, предложенные праймеры, исходя из теоретических расчетов, должны обладать 100% специфичностью.

На следующем этапе исследования были оптимизированы условия выделения РНК вируса и проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР, а также определены специфичность и чувствительность ПЦР-анализа. Размер ПЦР-продукта составил 350 пар нуклеотидов. Метод показал 100% специфичность и высокую чувствительность. Обнаружение коронавируса в фекалиях кошек свидетельствовало о носительстве его условно-патогенных штаммов в кишечнике, обнаружение FECV в транссудате и плазме крови — о развитии заболевания.

При исследовании методом РНГА положительным результатом считалось обнаружение у животного титра антител > 1:128. Однако это могло указывать как на вирусоносительство, так и на манифестированную форму инфекции. Кроме того, положительный титр мог быть обусловлен наличием контакта с коронавирусом ранее. В качестве материала от собак исследовались фекалии, и обнаружение в них РНК коронавируса свидетельствовало о заболевании, вызванном CCV.

В ходе эксперимента был исследован биологический материал, взятый у 193 кошек (таблица). Методом РНГА положительный результат был зафиксирован у 131 животного (титры антител > 1:128). При тестировании «сероположительных» кошек методом ПЦР РНК коронавируса была обнаружена в плазме и асцитной жидкости у 12 животных (9%), только в фекалиях — у 68 (52%) и у 51 (39%) — не обнаружена вовсе. Таким образом, 52% кошек с серопозитивным результатом являлись носителями условно-патогенных штаммов коронавируса, а 39% были здоровы. Очевидно, что исследование методом РНГА дало 63% ложноположительньгх результатов (в пересчете на общее количество исследованных животных).

Заключение Полученные результаты свидетельствуют о том, что диагностика коронавирусной инфекции кошек традиционным серологическим методом (РНГА) дает более 60% ложноположительных результатов, поскольку не позволяет дифференцировать состояние носительства от истинного заболевания. Кроме того, “сероположительными» считались животные, имевшие контакт с коронавирусом ранее.

Использование метода ПЦР позволило провести дифференциацию условно-патогенных и патогенных штаммов в связи с их раз личной локализацией в организме и отличить состояние носительства от заболевания. Таким образом, данные проведенного исследования говорят о целесообразности использования метода ПЦР для выявления коронавирусов кошек и собак и постановки окончательного диагноза.

В соответствии с приказом № 45 Департамента ветеринарии МСХ РФ в период с 03.08.2004 г. по 06.08.2004 г. были проведены комиссионные испытания тест-системы для диагностики инфекционного перитонита кошек методом ПЦР. Тест-система успешно прошла комиссионную апробацию, показав 100% специфичность и высокую чувствительность в рамках предложенной панели. В настоящее время тест-система «Коронавир» для выявления и идентификации коронавирусов кошек и собак, основанная на ПЦР, успешно используется в ветеринарной практике (ТУ 9388-142-00494189-05; РУ № Р077-1-3.5-0813 зарегистрирована в РФ за № ПВР-1-3.5/01556 от 30.06.06 г. сроком на 5 лет).

ПЦР- это полимеразная цепная реакция, основанная на принципе копирования определенного участка нити ДНК. За счет многократного увеличения в объеме ДНК-материала, становится возможным обнаружить в микроскопе искомые бактерии. Преимуществом ПЦР является:

• высокая чувствительность;
• высокая специфичность;
• выявление острых и латентных инфекций;
• возможность выявления любого из ныне известных возбудителей.

ПЦР в ветеринарии

В настоящее время метод ПЦР диагностики нашел широкое применение в ветеринарии. Данный метод исследования позволяет в короткие сроки получить достоверный ответ. К тому же для его проведения необходимо очень малое количество биологического материала, в отличии, например, от общего анализа крови, что существенно упрощает работу ветеринарным врачам. Как у людей, так и у животных материалом для постановки ПЦР могут быть:

• кровь и ее компоненты;
• моча;
• биоптат желудка;
• слюна;
• соскобы эпителиальных клеток.

Проведение ПЦР-диагностики кошкам

Во время обследования кошки ветеринаром, для подтверждения или опровержения предполагаемого диагноза может возникнуть необходимость сделать анализ кошке на ПЦР. Причиной назначения такого исследования могут быть наиболее часто встречающиеся и в тоже время трудно диагностируемые заболевания, такие как перитонит, ринотрахеит, коронавирус, токсоплазмоз и др.

Особо тяжелым заболеванием, при котором необходим ПЦР-метод является вирусный иммунодефицит кошек. Этот вирус поражает не только иммунную, но и нервную системы животного. Организм кошки становится ослабленным и беззащитным перед бактериями и вирусами, в результате чего животное погибает от вторичных инфекций. И дабы исключить наличие этого вируса, ветеринарный врач рекомендует проводить кошке полимеразную цепную реакцию.

Данный метод, помимо многообразия преимуществ, имеет ряд недостатков. Все аппараты для ПЦР-диагностики очень чувствительны, и поэтому малейшее его загрязнение может дать ложный положительный ответ. Так же не маловажной считается дороговизна оборудования и реактивов, поэтому не каждая ветклиника в Москве может его приобрести. Однако, диагностика заболеваний без этого метода становится все более затруднительной, поэтому проведение анализа ПЦР у кошек в Москве можно сделать в нашей клинике обратившись по контактным телефонам, или оставив заявку на сайте.